論文掲載に値する免疫蛍光画像を得るための5つのステップ


Posted by CSTジャパン on 2017/03/15 8:00:00


百聞は一見に如かずとはよく言ったもので、画像には1,000の言葉、免疫蛍光画像には1,000のタンパク質と同じくらいの価値があります。私達は、実験結果の説明に使用される画像から、本文と同じくらい多くの情報を得られるのです。CSTは、抗体の品質と厳格な検証プロセスに自信を持っています。免疫蛍光染色用一次抗体の製品ページやデータシートには、社内で得られた高品質の画像が掲載されています。免疫蛍光染色実験を成功させるためには、優れた一次抗体を最適なプロトコールに従って使うことが大切ですが (CST推奨のプロトコールはこちらでご確認ください)、それ以外にもいくつか考慮すべき点があります。 


ステップ1:細胞の健康状態

免疫蛍光画像から、お使いの細胞の健康状態がわかります。週末にインキュベーター内に忘れて放置されたプレートの細胞は多核化し、ストレス顆粒の形成やコンタミネーション、または死んだ細胞の破片が観察されることがあります (下記参照)。

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ステップ2:コンフルエンス (細胞密度)

時には、高密度な培養細胞におけるシグナル伝達、例えばZO-2 (#2847 ZO-2 Antibody) 染色によってタイトジャンクション形成を観察したいこともあります。しかし、細胞が高密度な場合、対比染色等によって細胞同士の境界を定義しないと、画像内の細胞の視認性が損なわれることがあります。一方、細胞があまりにもまばらだと、画像化する視野の選択に苦労します。


ステップ3:一次抗体の選択

十分に検証された抗体を使用すると、画像化プロセスはスムーズになります。最終的な画像を取得する前にあらゆる検証作業 (抗体濃度のタイトレーション、プロトコールの最適化) を行うことで、最良の結果が得られます。第一段階では、ハイコンテント解析ソフトウェアにより取得したグレースケール画像を使用して、プレートフォーマットで抗体染色強度を比較します (左)。次いで、単色または2色の蛍光画像を使用して、最適な抗体希釈濃度を決定します (中央)。こうした検証作業を行うことで、最終的に得られる3色の蛍光画像をベストイメージとすることができます (右)。

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ステップ4:二次抗体と対比染色

CSTでは、緑色蛍光が視覚的に印象的なAlexa Fluor® 488標識二次抗体やAlexa Fluor® 488で直接標識された抗体を使用して目的の標的を検出することが多くあります。対比染色やDNA色素は、抗体染色や細胞の視認性を高めるのに役立ちますが、目的の染色が目立たなくならないような染色方法を選択する必要があります。


ステップ5:視野とズーム

できる限り、適度な細胞数が認められる視野を選択して (3つ以上を推奨) 抗体の性能を実証します。細胞集団内での染色性が不均一な場合は、それを実証できる視野を確実に選ぶようにしてください。ズームアウトし過ぎると、有糸分裂や接着斑といった特定の細胞内局在を観察できない場合があります。


蛍光染色実験を多く経験すればするほど、より優れた画像が得られるようになります。目的の染色像を確認するまでウェル中のすべての視野を撮影しなければならないとしても、その努力の価値はあります。幸運を祈ります!

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優れた免疫蛍光染色プロトコールがあなたの研究を進めるのにどれほど役立つか、もっと詳しく知りたいですか?蛍光イメージングやフローサイトメトリーアッセイによる細胞シグナル伝達解析の最適化についてのビデオをご覧ください。

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Alexa Fluorは、Life Technologies Corporationの登録商標です。
DRAQ5はBiostatus Limitedの登録商標です。
MitoTrackerはMolecular Probes, Inc.の登録商標です。